病毒包装技术——腺相关病毒(AAV)包装（一）

摘要：腺相关病毒（AAV）是一种人细小病毒，因其作为基因治疗载体而备受关注。目前，大多数生成重组AAV（rAAV）的实验方案需要共转染一个载体质粒和一个包装质粒到腺病毒（Ad）感染的培养细胞中。然而，通过使用新的辅助质粒（pH3和pH5），可以避免Ad共转染的需求。这些辅助质粒表达AAV的rep和cap基因以及Ad的E2A、VAI和E4基因。当这些辅助质粒在未感染Ad的人293细胞中共转染时，rAAV载体的产量超过了pAAV/Ad包装质粒的80倍。此外，在rAAV制备过程中，有复制能力的AAV的含量少于0.00125%。这种双质粒转染系统因其简便性和高产量而使得AAV载体系统能够更广泛地应用。

1. 简介
   腺相关病毒（AAV）是一种常见的人细小病毒，具有自然缺陷、无包被和无致病性的特点。AAV的复制周期包括潜伏期和增殖期两个明显的阶段。在缺少辅助病毒（如腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒）或在基因毒条件下，AAV能够复制并产生子代病毒颗粒。在缺少辅助病毒的情况下，AAV将其基因组整合到19号染色体的一个特定位点，并保持整合状态直到随后的辅助病毒将其从潜伏状态中解救出来。AAV的位点特异性整合能力、自然缺陷以及无致病性使其成为基因治疗载体的可能选择。AAV基因组是一个线性、单链（ssDNA）分子，包含4680个核苷酸，每个末端含有一个145个碱基的末端重复序列（TR），这些TR序列形成发卡结构，用作DNA复制起始和包装重组AAV基因组所需的唯一已知顺式作用元件。

重组腺病毒载体（rAAV）的构建通常涉及剔除rep和cap基因并将感兴趣的转基因插入TR元件之间。关键的Ad辅助基因包括：E1a转录激活Ad和AAV基因，E1b和E4编码增进mRNA装运到细胞质的蛋白质，E2a表达一个ssDNA结合蛋白促进AAV DNA复制，VAI RNA基因生成一个小RNA转录物增进AAV capsid mRNA的翻译。然而，这个繁琐的过程的局限性阻碍了rAAV作为基因治疗载体的广泛应用。如上所述，载体的生成通常会导致明显的Ad污染，因此需要进行热处理和严格的纯化方法来灭活和去除Ad病毒颗粒的污染。尽管载体和包装质粒通常没有同源序列，但经常会产生具有复制能力的野生型AAV（rcAAV）。已经进行了许多尝试来改善rAAV载体的包装效率，包括开发表达AAV包装所需基因的细胞系、构建可以替代Ad感染的Ad辅助质粒以及开发携带rAAV载体基因组的重组Ad。

我们已经构建了新的辅助质粒，完全不需要在rAAV包装过程中感染Ad。这些质粒包含Ad基因组的VA、E2a和E4基因以及AAV的rep和cap基因。当这些辅助质粒转染到含有Ad5E1a和E1b基因的人293细胞中时，它们提供了一个有效的、无Ad污染的包装系统。我们使用这个新系统产生的rAAV滴度比使用pAAV/Ad包装质粒提高了80倍。此外，在任何载体制备过程中，Ad再也不能产生具有复制能力的AAV。

2. 材料和方法

2.1. 质粒、细胞和病毒
我们使用pTR-UF5质粒来优化所有包装实验，该质粒表达人绿色荧光蛋白。pAVbgal质粒含有AAV TR，位于巨细胞病毒（CMV）早期转录启动子和E.coli b半乳糖苷酶基因的两侧。作为比较，我们使用pAAV/Ad质粒作为包装质粒，该质粒含有AAV rep和cap基因以及Ad末端重复元件。

我们构建了两个辅助质粒pSH3和pSH5，其长度为19193bp。这些质粒包含来自Ad5的1.5kb HindIII到SalI片段，其中包含VAI和VAII基因（nt9831-11555）。我们将一个5.8kb BamHI到EcoRI片段（nt21563-27331）插入到pVA3的相同位点，该片段包含E2a基因。来自pSub201的4.3kb XbaI片段（AAV2中的nt177-4471），其中包含AAV rep和cap基因，随后被插入到pVAE2aE4的两个XbaI位点。pSH3和pSH5之间的区别在于4.3kb XbaI插入片段的方向。

人293细胞（Ad-5转化的胎肾上皮细胞）和Hela细胞在含有10%胎牛血清和抗生素的EMEM培养基中培养。细胞在37°C、5% CO2的条件下进行单层培养。对于对照的包装实验，使用m.o.i为15的Ad5感染细胞，感染后在无血清培养基中培养1小时，然后进行转染。Ad感染通过在Hela细胞上形成噬斑来进行滴定。

Fig.1. rAAV包装所用的质粒（A）pTR-UF5含有CMV启动子（箭头）驱动的人gfp基因和HSV-tk启动子（箭头）驱动的neoR基因。质粒两侧有AAV TR元件（填充的方块）。pAVbgal含有E.coli b-半乳糖苷酶基因，受CMV启动子（箭头）控制。转录盒两侧是AAV TR元件（填充的方块）。pAAV/Ad含有AAV rep和cap基因，两侧是Ad末端重复元件（空方块）（B）pSH3和pSH5含有Ad E4、E2a和VA RNA基因。两个质粒也含有AAV rep和cap基因。图下的数字指的是Ad和AAV基因组中的核苷酸数目。pSH3和pSH5的区别是在AAV DNA序列中的方向。为了清楚起见，质粒图谱的其余部分未列出。

2.2. rAAV载体产生和滴定
对于小规模的包装实验，将8×10^5个293细胞种植在35mm的6孔培养板中。24小时后，使用lipofectamin进行转染，转染培养物的载体和辅助质粒比例如表1所示。根据载体和辅助质粒的大小，1mg:3mg的比例相当于pTR-UF5和pSH3/5的摩尔比为1:1。pAAV/Ad质粒与Ad共感染，使用3或5mg的pAAV/Ad与1mg的pTR-UF5共感染。添加DNA到细胞之前，将病毒吸附到无血清培养基中的细胞单层上1小时。转染后72小时，将细胞刮下并收集到2ml的培养基中。随后用1ml的无菌PBS洗涤细胞。将PBS加入细胞悬浮液中，经过5次冻融超声破碎（3,36mm 45s）。离心提取物10分钟以去除细胞碎片，上清液中含有重组载体vAVgfp，将用于随后的转导。在转导之前，对这些转染的Ad进行56°C热处理30分钟。对于大规模的载体包装，将5×10^6个293细胞种植在20×1 125px的培养板中，并使用钙磷酸盐沉淀法进行转染。

72小时后，收集培养物，低速离心沉淀细胞，冻融4次，然后进行超声破碎。将CsCl2加入裂解物中，最终浓度为1.41g/ml，使用折射指数确定。将悬浮液在SW41转头上以40,000rpm离心48小时。从梯度中去除含有可见载体的条带，其密度可通过测量折射指数来确定。重复CsCl2离心步骤，获得的载体经过透析，更换4次PBS，保存在-80°C。使用以下方法对产生的载体vAVgal进行滴定。为了确定rAAV的滴度，将4×10^4个Hela细胞种植在24孔培养板中，感染m.o.i为10的Ad，使用一系列稀释的转染细胞裂解液进行转导。2-3天后，在观察到广泛的细胞病理效应之前，使用带有EPI-荧光设备的DIAPHOT-Nikon倒置显微镜在20倍放大下观察。计数产生良好分离的荧光细胞的稀释倍数，每个阳性细胞代表一个载体转导单位（T.U.）。为了确定rAAVgal载体的滴度，使用纯化载体的稀释液感染细胞。细胞用PBS溶解的95%甲醇固定，用X-gal进行染色。每个蓝色染色的细胞代表一个载体转导单位（T.U.）。使用点印迹杂交分析确定载体基因组的拷贝数，如前述方法测定A260。

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